Wat is fluorescentiespectroscopie?
Fluorescentiespectroscopie analyseert de fluorescentie van moleculen op basis van hun fluorescerende eigenschappen.
Fluorescentie is de luminescentie die optreedt wanneer een molecuul wordt geëxciteerd door een foton naar een elektronisch aangeslagen toestand om terug te keren naar de grondtoestand.
Fluorescentiespectroscopie gebruikt een lichtstraal om elektronen in bepaalde samengestelde moleculen te exciteren en ervoor te zorgen dat ze licht uitstralen. Licht gaat door een monochromator en komt een detector binnen waar het wordt gedetecteerd, die wordt gebruikt om moleculen of veranderingen in moleculen te meten en te identificeren.
Inleiding tot Fluorescence Steady-State Spectroscopie en Lifetime Testing
Fluorescentie verwijst in grote lijnen naar het fenomeen luminescentie, het licht dat wordt uitgestraald door moleculen. Er zijn verschillende soorten gloed.
Fotoluminescentie is de emissie van fotonen die worden geëxciteerd door lichtenergie of fotonen.
Chemiluminescentie, gedefinieerd als de luminescentie van fotonen die worden geëxciteerd door chemische energie, omvat bioluminescentie, zoals te zien is bij vuurvliegjes en veel zeeleven.
Elektroluminescentie is de emissie van fotonen wanneer elektrische energie of een sterk elektrisch veld fotonen stimuleert, zoals bij sommige verlichtingstoepassingen.
Specifiek is fluorescentie een soort fotoluminescentie waarbij licht elektronen in een aangeslagen toestand brengt. De aangeslagen toestand verliest snel thermische energie aan de omgeving door trillingen, en zendt vervolgens fotonen uit vanuit de laagste aangeslagen singlet-toestand. Dit fotonenemissieproces concurreert met andere niet-stralingsprocessen, waaronder energieoverdracht en warmteverlies.
Wanneer de term "fluorescentie" wordt gebruikt, is dezelfde meetmethode in het algemeen van toepassing op elk van de bovengenoemde klassen van luminescentie.
Wat is fluorescentiespectroscopie?
Fluorescentie-excitatie en emissiespectra spiegelen elkaar. Fluorescentiespectroscopie gebruikt emissie en excitatie om te zien hoe een monster verandert.
Fig. 1: Een fluorescentie-excitatiespectrum (blauw) en een emissiespectrum (paars) zijn spiegelbeelden van elkaar
Steady-state fluorescentiespectroscopie is wanneer een molecuul fluoresceert wanneer het wordt geëxciteerd door een constante lichtbron, en de uitgezonden fotonen of intensiteit wordt gedetecteerd als een functie van de golflengte. Fluorescentie-emissiespectrum is wanneer de excitatiegolflengte vast is, de emissiegolflengte wordt gescand en de relatie tussen de intensiteit en de emissiegolflengte wordt verkregen.
Het fluorescentie-excitatiespectrum is wanneer de emissiegolflengte wordt vastgesteld, door de golflengte van de excitatiemonochromator te veranderen, waarbij de intensiteit op verschillende golflengten wordt gescand. Op deze manier levert het spectrum informatie over de monster- en absorptiegolflengten om de optimale enkele emissiegolflengte voor detectie van emissie te selecteren. Het is vergelijkbaar met absorptiespectroscopie, maar is een meer gevoelige techniek in termen van detectielimieten en moleculaire specificiteit. Excitatiespectra zijn specifiek voor een enkele emissiegolflengte/-soort, in verhouding tot de absorptiespectra van alle absorberende soorten in de meetoplossing of het monster. De emissie- en excitatiespectra van een bepaalde fluorofoor zijn spiegelbeelden van elkaar. Typisch verschijnen emissiespectra bij hogere golflengten (lagere energieën) dan excitatie- of absorptiespectra
Deze twee spectrale typen (emissie en excitatie) worden gebruikt om te observeren hoe het monster verandert. De spectrale intensiteit en piekgolflengte kunnen variëren met variabelen zoals temperatuur, concentratie of interacties met omringende moleculen. Dit omvat het uitdoven van moleculen en moleculen of materialen die betrokken zijn bij energieoverdracht. Sommige fluoroforen zijn gevoelig voor eigenschappen van de oplosmiddelomgeving, zoals pH, polariteit en bepaalde ionconcentraties.
Welke soorten moleculen of materialen vertonen fluorescentie?
Fluorescentie-emissiespectra van enkele veel voorkomende fluoroforen. Fluorforen spelen de centrale rol in fluorescentiespectroscopie en maken dit type spectroscopie tot een zeer gevoelige techniek.
Fig. 2: Fluorescentie-emissiespectra van enkele veel voorkomende fluoroforen over het UV- en zichtbare spectrum
Fluorescerende moleculen en materialen zijn er in alle soorten en maten. Sommige zijn inherent fluorescerend, zoals chlorofyl en de aminozuurresiduen tryptofaan (Trp), fenylalanine (Phe) en tyrosine (Tyr). Andere zijn moleculen die zijn gesynthetiseerd als stabiele organische kleurstoffen of tags die kunnen worden toegevoegd aan andere niet-fluorescerende systemen. Over het algemeen hebben organische fluorescerende moleculen structurele kenmerken zoals aromatische ringen en π-geconjugeerde elektronen. Afhankelijk van hun grootte en structuur, zenden organische kleurstoffen licht uit in golflengten variërend van ultraviolet tot nabij-infrarood.
Hieronder staan enkele willekeurige veelvoorkomende fluoroforen waarvan de emissie kan worden gezien over het UV-Vis-bereik. Voor sommige zeldzame aardelementen, zoals lanthaniden, treden elektronische overgangen als gevolg van ladingsoverdracht van metalen liganden op tussen 4f-5d of zelfs 4f-4f-orbitalen, omdat de hogere elektronenorbitalen worden gevuld. (Bunzli, 1989) Er zijn veel moleculen die licht uitstralen in de natuur, zoals sommige aminozuren, chlorofyl en natuurlijke pigmenten. Weer andere zijn zorgvuldig ontworpen voor speciaal gebruik in fluorescentiespectroscopie
Voorbeelden van fluorescerende moleculen en materialen:
Aminozuren (Trp, Phe, Tyr)
Basenpaarderivaten (2-AP, 3-MI, 6-MI, 6-MAP, pyrrool-c, tC)
chlorofyl
Fluorescerende eiwitten (FP's)
Organische kleurstoffen (fluoresceïne, rhodamine, n-aminocoumarinen en hun derivaten)
Zeldzame aarde-elementen (Lanthaniden)
halfgeleider
kwantumstippen
enkelvoudige-ommuurde koolstofnanobuisjes
Zonne-accu
Pigment, galvaniseren
fosfor
Meer…
Andere moleculen en materialen zoals fluorescerende eiwitten, halfgeleiders, fosforen en zeldzame aardelementen zijn veelgebruikte fluorescerende monsters. Polymeren die geconjugeerde aromatische koolwaterstoffen of dienen bevatten, hebben vaak ook fluorescerende eigenschappen. Natuurlijk hebben wetenschappers ook gewerkt aan het creëren van nieuwe materialen.
